運用大品類醇物質(zhì)冷化倉貯MMTV-Wnt-1構(gòu)架體鼠類胚胎
培養(yǎng)液以M16作為解凍后胚胎的體外培養(yǎng)液。（M16購至Sigma公司）胚胎冷凍和解凍程序裝管如下所示，裝管操作為如下：用帶有16號針頭的0.5ml注射器從冷凍管有冷凍裝管示意棉塞的一頭（中0），皮試儀先吸入一段7cm的半乳糖（中1）；接著吸一段氣泡后，吸入約0.5cm的EG-8，以清洗管壁上粘附的半乳糖（中2）；然后再吸入一段氣泡，接著再吸入約0.5cm的EG-8，移入胚胎（中3）；后吸一段氣泡，并再一次吸入約0.5cm的EG-8（中4）后熱封口（中5）。
冷凍速將裝入胚胎并封口的冷凍管2、3、4段投入液氮中，使胚胎在短的時間冷凍。解凍將冷凍管從液氮中取出并迅速置于15～20℃水浴中，使管內(nèi)液體迅速解凍，待液體呈流動態(tài)后，以手指彈擊冷凍管，使半乳糖與EG-8混和，然后剪去兩端將混和后的液體倒入予先放有約200Ll半乳糖液的培養(yǎng)皿中。
胚胎培養(yǎng)將經(jīng)解凍稀釋的胚胎吸出，在M16中清洗數(shù)次后，置于上覆石蠟油的M16培養(yǎng)皿中，在5CO2，37℃下進行微滴培養(yǎng)（每滴約20Ll），每滴胚胎數(shù)10～20枚。觀察的發(fā)育和孵化（發(fā)育至脫透明帶）數(shù)。
胚胎移植假孕鼠將正常ICR母鼠與結(jié)扎ICR公鼠1∶1合籠，第2天早晨檢查陰栓，見栓者為假孕第1天鼠。子宮角移植選擇假孕第3天的小鼠作為受體，進行子宮角移植，每側(cè)移植6～10枚經(jīng)M16培養(yǎng)4～10h后形態(tài)正常的解凍胚胎。統(tǒng)計分析用SAS系統(tǒng)對數(shù)據(jù)進行V2獨立性檢驗。
結(jié)果EG-2平衡對冷凍效果的影響本實驗比較了胚胎經(jīng)EG-2平衡后進入EG-8與不經(jīng)EG-2平衡直接進入EG-8對冷凍效果的影響，結(jié)果。經(jīng)EG-2平衡與直接加入EG-8冷凍效果比較組別冷凍胚胎數(shù)回收胚胎數(shù)培養(yǎng)發(fā)育數(shù)孵化數(shù)不經(jīng)EG-2平衡括號內(nèi)為相應(yīng)百分數(shù)；
P<0.01，與不經(jīng)EG-2平衡組相比。可以看出，雖然平衡與不平衡對冷凍胚胎的回收率（88.66vs85.71）沒有顯著差異，但胚胎在進入EG-8前先經(jīng)EG-2平衡的培養(yǎng)發(fā)育率和孵化率顯著高于不平衡組，分別為（82.56vs28.12）和（56.98vs11.46），這一結(jié)果表明，經(jīng)EG-2平衡的冷凍效果要優(yōu)于不平衡。
不同解凍稀釋時間對胚胎冷凍效果的影響在固定了平衡時間為4～6min的條件下，實驗中又比較了解凍時，在半乳糖稀釋液中停留不同時間對冷凍胚胎發(fā)育的影響?？梢钥闯?，解凍時間在3～5min胚胎培養(yǎng)發(fā)育率和孵化率顯著高于解凍時間為0～3min和5～8min，說明解凍時，在半乳糖稀釋液中停留時間在3～5min有利于胚胎解凍后的發(fā)育。
解凍后胚胎移植效果實驗中將經(jīng)佳程序冷凍解凍后回收的形態(tài)正常的181胚胎移植給12只假孕母鼠，其中10只懷孕，共產(chǎn)仔69只，產(chǎn)仔率為38.36.移植出生小鼠的PCR整合檢測對冷凍移植出生的小鼠，在21日齡剪尾，抽提組織DNA，PCR檢測。結(jié)果表明66只（其中有3只在斷奶前死亡）被檢小鼠中有31只陽性。
討論1985年Rall等[5]開發(fā)了胚胎玻璃化冷凍保存技術(shù)，初主要以二甲基亞砜，乙酰胺等為細胞內(nèi)液抗凍保護劑，由于其化學(xué)毒性較大，在投入液氮前需階段降溫約30min，且濃度由低到高，從而使操作過程變得復(fù)雜，不利于推廣。
本試驗采用分子量小，而滲透壓強，化學(xué)毒性較低的乙二醇為細胞內(nèi)液抗凍保護劑，急速冷卻后溶液的粘度增加，迅速形成玻璃化狀態(tài)，抑制了冰晶的形成，可以達到胚胎的超快速冷凍，整個冷凍過程僅持續(xù)數(shù)分鐘，且實驗所需設(shè)備簡單，有利于大規(guī)模推廣應(yīng)用。
