HBV-C作用型鼠類迅捷構(gòu)架冷化方略的構(gòu)建
解凍液的配制DPBS中加入蔗糖至終濃度為015mol/L.冷凍程序?qū)?0枚胚胎置于冷凍液中平衡片刻，裝入0125ml的冷凍塑料細(xì)管中，裝管可分為五段法（解凍液、冷凍液、冷凍液+胚胎，冷凍液、解凍液）痔瘡套扎器和二段法（解凍液、冷凍液+胚胎），封好細(xì)管的兩端。將管子的一半伸入到液N2面下，片刻后全部投入液N2中。胚胎在冷凍液中的平衡時(shí)間控制在35min內(nèi)。
解凍程序?qū)⒗鋬龉苤糜?025e水浴中解凍5s，剪斷細(xì)管兩端，然后將胚胎吹入解凍液中處理5min.用M16洗35次后培養(yǎng)。胚胎培養(yǎng)用M16培養(yǎng)液20Ll，石蠟油覆蓋，5CO2，37e下進(jìn)行微滴培養(yǎng)，每液滴中胚胎數(shù)不超過(guò)10枚。
胚胎移植結(jié)扎ICR公鼠與正常ICR母鼠以1B2合籠，第2天清晨檢查陰栓，見(jiàn)栓者為妊娠第1天，選擇妊娠第3天小鼠作為受體，進(jìn)行子宮角移植，每側(cè)移植68枚經(jīng)M16培養(yǎng)液培養(yǎng)4h后形態(tài)正常的解凍后胚胎。統(tǒng)計(jì)分析V2獨(dú)立性檢驗(yàn)。
結(jié)果不同EG濃度對(duì)冷凍效果的影響本實(shí)驗(yàn)比較了不同的EG濃度對(duì)冷凍效果的影響，結(jié)果?？梢钥闯觯?0EG組解凍后胚胎的發(fā)育率及孵化率顯著高于20和40組，而20組和40組之間差異不顯著，結(jié)果表明，30EG冷凍效果好。
不同階段胚胎的冷凍效果本實(shí)驗(yàn)比較了不同階段胚胎的冷凍效果，結(jié)果?？梢钥闯觯旅苌ｉ┡吲c囊胚解凍后的發(fā)育率差異不顯著，前者的孵化率則顯著高于后者。不同裝管法對(duì)胚胎回收率的影響本實(shí)驗(yàn)比較了不同裝管方法對(duì)胚胎回收率的影響，結(jié)果?？梢钥闯?，五段法胚胎回收率顯著高于二段法。
解凍后胚胎移植效果將解凍后形態(tài)正常的82枚胚胎移植給8只假孕母鼠，有5只懷孕（51枚胚胎），懷孕率為6215，共產(chǎn)下28只小鼠，產(chǎn)仔率為5419.
討論用胚胎冷凍的方法對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行種質(zhì)保存首先必須獲得攜帶外源基因的胚胎，大量文獻(xiàn)證明142，通過(guò)顯微注射法建立的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其外源基因隨機(jī)整合在染色體上，并能夠穩(wěn)定地進(jìn)行遺傳，因此我們可能用整合陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因雄性個(gè)體（純合子或雜合子）與正常的經(jīng)超排處理的雌性個(gè)體進(jìn)行交配獲得攜帶外源基因的胚胎。通過(guò)這種方法產(chǎn)生的后代，從理論上來(lái)說(shuō)，其外源基因的整合率為100或50.本研究中用攜帶HBV-C基因的轉(zhuǎn)基因公鼠與正常ICR母鼠交配獲得的胚胎中也應(yīng)有100或50的攜帶外源基因。
Rall等1521985年建立了玻璃化冷凍胚胎的方法，隨后該技術(shù)得到了不斷的發(fā)展和完善，冷凍程序越來(lái)越簡(jiǎn)單，解凍后的胚胎存活率越來(lái)越高。Kasai等162比較了各種抗凍保護(hù)劑對(duì)胚胎的化學(xué)毒性作用，發(fā)現(xiàn)乙酰胺毒性大，其次為丙二醇、DMSO、丙三醇等，乙二醇毒性低。同時(shí)，由于乙二醇標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量小，滲透速度快，從而進(jìn)一步降低對(duì)胚胎的毒性作用。因此，本實(shí)驗(yàn)采用EG抗凍保護(hù)劑，并比較了不同的EG濃度對(duì)胚胎冷凍效果的影響，結(jié)果表明體積分?jǐn)?shù)30EG濃度效果佳，這與Kasai的結(jié)果一致。
玻璃化冷凍過(guò)程中，環(huán)境的溫度對(duì)冷凍效果有很大影響，因?yàn)榭箖霰Ｗo(hù)劑的毒性與溫度有關(guān)。Kasai認(rèn)為要將溫度嚴(yán)格控制在（20015）e，李玉欣（通訊聯(lián)系）報(bào)道室溫應(yīng)控制在25e.而本實(shí)驗(yàn)在操作過(guò)程中，室溫控制在2025e，并提前10h將有關(guān)的溶液及器皿置于其中，使其溫度與室溫一致。靜脈顯示儀溫度的不同也是造成解凍后孵化率不高的一個(gè)因素，但本實(shí)驗(yàn)室采用這一溫度范圍更符合大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室的實(shí)情，更容易應(yīng)用于大規(guī)模的胚胎庫(kù)的建立。
